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細胞學堂 | 細胞轉染必看的常見問題盤點

更新時間:2024-09-18  |  點擊率:1115


細胞轉染是將外源性核酸(如DNA、RNA)引入細胞內的一種技術,它主要用于基因表達、基因編輯(基因敲入/敲除)、蛋白質功能以及細胞功能研究等。簡單來說,通過轉染,我們可以將新的遺傳信息帶入細胞,觀察這些信息對細胞行為的影響。




本期,我們將為大家帶來細胞轉染分類的介紹與常見問題解析,幫助您快速上手,確保細胞轉染實驗順利進行。





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 細胞轉染分類

根據轉染方式分類


化學轉染:

使用化學轉染試劑(如脂質體、陽離子聚合物等)將核酸包裹并引入細胞。這種方法操作簡便,適用于多種細胞類型。

物理轉染:

利用物理手段(如電穿孔、顯微注射、基因槍等),使細胞膜暫時性開放或直接將核酸注入細胞。這種方法適用于部分難以轉染的細胞類型,但需要專業設備。

生物轉染:

利用病毒載體(如慢病毒、腺病毒等)將核酸導入細胞。病毒轉染效率高,但同時成本高且具有一定安全風險。




根據轉染是否把外源核酸

整合到宿主染色體分類


瞬時轉染:

將外源性核酸引入細胞,使其在短時間內表達目標基因,不整合在細胞的染色體上。核酸在細胞內僅存在較短時間,適合于需要快速獲取數據的實驗,能夠迅速檢測基因功能或表達。

穩定轉染:

將外源性核酸引入細胞,使其整合到細胞染色體中,實現長期表達。通過篩選和擴增,雖然建立過程較長,但提供了穩定的表達系統,適用于生產和長期研究。





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 細胞培養注意事項



01

如何選擇合適的轉染方法?

目前細胞轉染主要有物理、化學和生物三類轉染方法。物理轉染需要特定儀器、耗材及充分的轉染參數測試,才能獲得較好的轉染效果,一般實驗室無法滿足物理轉染的硬件要求;化學轉染是目前較為通用的一種方法,其憑借價格便宜、操作簡單而被廣泛使用;但部分類型細胞對化學轉染不敏感,轉染效率低,此類細胞可嘗試生物轉染方法,也就是通過病毒進行轉染。但是需要注意的是,如果細胞自身是難轉染類型,即使用病毒感染也不一定會獲得理想的轉染效果。

02

為什么細胞轉染效率不高?

細胞轉染效率不高可能是受到了以下因素的影響:

細胞類型和狀態:轉染試劑對不同細胞的轉染效率不盡相同;轉染前細胞狀態對轉染效率影響較大,此外,細胞密度也會影響轉染效率。

轉染試劑使用量:轉染試劑用量過多或過少都可能影響轉染效果,可根據說明書推薦的使用量進一步梯度摸索,確定目標細胞的最佳轉染條件。

核酸質量:使用的DNA或RNA質量不佳(如降解或污染)會影響轉染效率。

轉染操作:例如制備轉染復合物時孵育時間過長、轉染后的細胞孵育時間不夠等都可能導致效率下降。

03

配制轉染復合物時一定要用無血清培養基嗎?

通常在準備核酸和轉染試劑稀釋液時,建議使用無血清的培養基或轉染試劑自帶的組分。因為血清中含有大量的蛋白質,在轉染過程中,蛋白質可能干擾陽離子脂質體/聚合物對核酸的吸附,影響轉染效率。現在市售的部分轉染試劑進行了一些改進,可以在轉染時使用含血清的培養基,所以配制轉染復合物時,可根據使用的具體轉染試劑說明書,選擇是否使用無血清培養基。

04

電轉后細胞死亡率高,如何調整優化?

細胞狀態:細胞電轉前,保證細胞生長狀態良好,排除細胞污染情況。

細胞密度:確保電轉細胞的密度適中,細胞密度過高或過低都可能影響轉染效果和細胞存活率。

電轉參數:優化電壓、脈沖時間和脈沖次數,針對目標細胞,確定最佳的電轉參數。

電轉緩沖液:使用合適的電轉緩沖液,確保能夠有效導電,同時減少細胞損傷。

05

轉染了抗性基因的細胞加藥篩選后,為什么都死了?

可能是受到了以下因素的影響:

加藥時間細胞在轉染帶抗性基因的質粒后,需要24-48 h表達抗性基因,避免過早加入藥物進行篩選,一般建議轉染48 h后再加藥,具體時間可以預實驗摸索下。

加藥濃度:若藥物濃度設置過高,超過了抗性基因能夠應對的范圍,導致即使轉染了抗性基因,細胞也無法存活。

抗性基因:抗性基因選擇錯誤或轉染過程中抗性基因發生突變或丟失,都會導致細胞抗性功能喪失。




以上是關于細胞轉染的分類介紹與常見問題解析,更多細胞培養干貨,請持續關注細胞學堂專欄~


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